0 引言

       抑郁症为21世纪重大疾病之一，其特征为持续性的情绪压抑和兴趣丧失，引起严重自杀倾向和沉重社会负担^{[1, 2, 3]}。世界卫生组织预测，2030年抑郁症将在疾病总负担中居于首位^[4]。药物、心理疏导及神经电刺激等方式是目前治疗抑郁症的常用方法^{[5, 6, 7]}，但疗效一致性难以评估，使临床无法制订针对性的治疗方案^{[8, 9]}。当前的专家共识认为^[10]，可借助临床问诊、主观评估工具等多种方式评估抑郁症疗效，但依然存在认知症状主、客观评估结果不一致以及对评定者要求较高等问题，缺乏客观、无创的有效评价方法。

       谷氨酸（glutamate, Glu）是一种重要的兴奋性神经递质，广泛分布于中枢神经系统^[11]，且在抑郁症发病机制中扮演重要角色^[12]。既往研究证实抑郁症患者的Glu代谢异常，损伤大脑突触可塑性，且影响人类情绪、认知、学习等^[13]。因此，准确检测抑郁症患者治疗前后脑内Glu浓度变化，可能会为评估疗效带来更多有价值的信息，但提取和分析脑内Glu具有较大难度，且具有创伤性。磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）可无创检测脑内神经代谢物浓度，在抑郁症的相关研究中有重要的应用价值^[14]。氢质子磁共振波谱（proton magnetic resonance spectroscopy, ¹H-MRS）成像技术能够测定脑的代谢物含量，但存在成像采集时间长、空间分辨率差、量化结果差异较大等缺点^[15]。磁共振谷氨酸化学交换饱和转移（glutamate chemical exchange saturation transfer, GluCEST）成像技术是一种新型定量分子成像技术，主要基于化学交换饱和转移（chemical exchange saturation transfer, CEST）效应，是Glu分子中的氢原子与游离水之间的化学交换精准检测组织中Glu水平。在生理范围内，GluCEST效应与Glu浓度呈线性正相关，其敏感性是¹H-MRS的700倍，且具有较高空间分辨率，已广泛应用于多种脑部疾病的研究^{[15, 16]}。目前，将GluCEST成像技术应用于评估氟西汀治疗抑郁症疗效的研究较为少见，因GluCEST成像技术对场强要求较高，基于成像原理中交换条件的全面评估，GluCEST需要7 T或更高的场强，临床使用的3 T MR扫描仪不能区分Glu和谷氨酰胺（glutamine, Gln），检测结果的特异性较差，不能获得高质量的图像，因此检测Glu浓度、实现抑郁症的疗效评估，具有一定的局限性^{[15, 16]}。7.0 T MR满足其对场强的需求，同时显示GluCEST成像技术的优势，是一种具有较高敏感性和空间分辨率的分子成像技术，可无创定量检测脑区的Glu浓度^[17]。目前有研究应用7.0 T GluCEST成像评估抑郁症模型大鼠海马区Glu变化，但并未涉及疗效^[18]，有研究应用7.0 T GluCEST成像评价氯胺酮对抑郁模型大鼠的疗效^[19]，但氯胺酮药效持续时间较短，并具有致幻、易成瘾性等不良反应，实验中造模时间较短，仅研究了速效抗抑郁药作用的一个时间点，更多时间点未探索。氟西汀是选择性5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine, 5-HT）再摄取抑制剂类药物，是目前临床治疗抑郁症的一线用药。氟西汀的作用机制为可选择性抑制5-HT转运体，阻断突触前膜对5-HT的再摄取，导致突触间隙5-HT浓度升高，从而延长和增强5-HT的作用，产生抗抑郁效果，且药效持久^[20]，因此，本研究通过应用7.0 T MR GluCEST成像技术测定大鼠海马区Glu浓度变化，分析定量结果与行为学的相关性，继而评价氟西汀治疗抑郁症的疗效，为抑郁症疗效评估提供新方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

       本研究通过了滨州医学院附属医院伦理委员会批准，已获得实验动物管理及福利伦理审查决议书（批准文号：20211008-23）。健康雄性SD大鼠36只，SPF级，体重200~240 g，购于山东绿叶制药有限公司。将SD大鼠置于昼夜节律的光照条件下，室温20 ℃~26 ℃，湿度40%~70%，采用人工照明，明暗各12 h，自由进食。饲养至少1周以适应实验室环境，再随机分为三组（每组12只）：正常对照组、抑郁模型组（CUMS组）和抑郁模型给药组（CUMS-fluoxetine组）。正常对照组正常饲养，不做其他处理；CUMS组采用CUMS模型诱导大鼠抑郁样行为，在参考相关研究^{[21, 22]}及自身实验室的设备及环境条件下设定方案，详见表1；CUMS-fluoxetine组按照CUMS造模方法进行并同时灌胃给予盐酸氟西汀混悬液，一日两次，每次10 mg/kg。

       其中，0.5%羧甲基纤维素钠溶液作为溶剂，配置方法如下：称取5 g羧甲基纤维素钠固体粉末（国药集团化学试剂有限公司，中国），多次、少量加入到1 L的无菌去离子水中，搅拌直至羧甲基纤维素钠全部溶解；氟西汀是治疗抑郁症药物，氟西汀混悬液配置方法如下：将盐酸氟西汀分散片剂（常州华生制药有限公司，中国，20 mg/片）碾碎，混悬于0.5%的羧甲基纤维素钠。

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表1  CUMS组造模方法
Tab. 1  CUMS group molding method

1.2 行为学测试

1.2.1 糖水偏好测试

       前两天动物适应性饮用蔗糖溶液，第一天在鼠笼放置2瓶相同体积的1%蔗糖溶液，第二天在饲养笼上分别放置1瓶纯净水，1瓶1%蔗糖水。第三天开始检测大鼠糖水偏爱率，在饲养笼上分别放置1瓶纯净水，1瓶1%蔗糖水，使其能自由饮用，为避免其对1%蔗糖水瓶产生位置偏好，每2 h交换纯净水瓶和1%蔗糖水瓶的位置。12 h后，对纯净水瓶、1%蔗糖水瓶称重并计算大鼠在测试过程中分别饮用纯净水、1%蔗糖水的重量。蔗糖水偏爱指数越低，则大鼠快感缺失（抑郁核心症状）越严重^{[21, 22]}。

1.2.2 强迫游泳测试

       动物在水中的不动时间能够反映绝望状态，进而评估其抑郁程度。本实验中使用强迫游泳测试方法是在参考相关文献的基础上^{[21, 22]}，结合自身实验室的设备及环境条件略加改动而完成。具体的操作如下：（1）采用开放式玻璃圆筒（高度33 cm，直径16 cm），水深10 cm，水温设置为（23±2）℃；（2）将大鼠轻轻放入圆筒中，计时6 min；（3）通过Any-maze动物行为分析系统（Stoelting公司，美国）观察并记录第2~6 min大鼠处于停滞不动（绝望状态）的时间。实验结束后，将大鼠捞出、擦干，并放回原来饲养笼中。

1.2.3 旷场测试

       旷场测试又被称作开箱实验，是评价实验动物在陌生环境条件下自主行为、探索行为和焦虑程度的方法。旷场实验使用的场箱（蓝色塑料开放箱）尺寸为50 cm×50 cm×50 cm，并将场箱底部中央25 cm×25 cm的区域作为旷场的中心区域。旷场实验需要在灰暗的灯光条件下完成，且保证大鼠至少适应此环境1 h。实验开始时，将大鼠放置在场箱的中央并允许在开放箱中自由探索，实验时间为10 min。通过Any-maze动物行为分析系统（Stoelting公司，美国）观察并记录10 min内大鼠在场箱中的总移动距离、滞留中心区域的时间。每完成一次实验，均使用75%酒精清理场箱，避免粪便、尿液等其他气味影响实验数据。

1.3 成像扫描方法与技术参数

       使用7.0 T小动物MRI（70/20 Pharma Scan，Bruker，德国）采集图像，采用单通道表面线圈完成射频传输和接收。成像扫描前，使用异氟烷（山东科源制药股份有限公司，中国）麻醉大鼠（1.8%~2.5%浓度进行诱导，1.3%~1.5%浓度用于扫描期间麻醉状态维持）。扫描期间，每只大鼠均以俯卧位固定于扫描床上，并配备脉搏血氧仪监测扫描期间大鼠的呼吸频率；同时，扫描床安装两根水暖循环管（37.5 ℃），以维持大鼠体温。

       MR扫描序列及参数如下：（1）T2WI，使用快速采集弛豫增强序列，TR 3500 ms，TE 33 ms，视野（field of view, FOV）35 mm×35 mm，矩阵尺寸256×256，层厚0.8 mm，激励次数4；（2）GluCEST，扫描时选择一个最大程度观察到海马结构的层面进行扫描，采用连续波射频饱和脉冲的Fatrare序列获取单层GluCEST数据，TR 5500 ms，TE 3.56 ms，矩阵尺寸70×70，FOV 35 mm×35 mm，层厚1 mm，射频饱和功率3.6 μT，可获得-5~+5 ppm范围内、间隔为0.2 ppm的51个频率偏移的Z谱以及不饱和图像。

1.4 图像处理与分析

       使用MATLAB（Mathworks，Natick，MA，美国，R2018a）处理GluCEST图像。在分析CEST数据前，对图像进行B0和B1校正：首先，通过公式Ssat/S0得到不同感兴趣区的Z谱；随后，以Z谱中0所在的纵坐标为对称轴，两侧做差，得到非对称性磁化率（asymmetric magnetization rate, MTRasym），并得到伪彩图；最后，计算3.0 ppm处的非对称性磁化率值，得到勾画区域的Glu相对浓度值。Glu浓度的计算见式（1）。

       其中，Δω为频率偏移，S0为不饱和信号强度。为保证GluCEST测定结果的准确性，由从事影像诊断专业10年以上的两位副主任医师分别在海马区仔细绘制ROI。每侧重复测量三次，并取其平均值。

1.5 统计学分析

       使用SPSS 26.0统计软件分析数据，GraphPad Prism 9.0软件绘制图表。数据以均数±标准差表示，通过两独立样本t检验分别比较CUMS组与正常对照组、CUMS-fluoxetine组与CUMS组大鼠海马Glu浓度，通过配对t检验比较每组左右侧海马Glu浓度，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学测试

       三组大鼠28天时进行糖水偏好测试，结果显示：CUMS组糖水偏爱率较正常对照组明显降低，CUMS-fluoxetin组大鼠糖水偏爱率提高；29天时进行强迫游泳测试，结果显示：CUMS组大鼠的不动时间延长，CUMS-fluoxetine组大鼠的不动时间缩短。30天时进行旷场测试，结果显示：CUMS组大鼠的运动能力降低，CUMS-fluoxetine组大鼠运动能力增加（图1）。

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图1  大鼠行为学测试图。1A为行为学测试流程图。实验造模为4周，28天时进行SPT（1B），29天时进行FST（1C），30天时进行OFT（1D），31天时进行7.0 T MR GluCEST扫描。SPT：糖水偏好测试；FST：强迫游泳测试；OFT：旷场测试；CEST：7.0 T MR GluCEST扫描序列；CUMS：慢性不可预知轻度应激模型；CUMS-fluoxetine：慢性不可预知轻度应激模型氟西汀给药组。*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。
Fig. 1  Behavioral test of rats. 1A: Flow chart of behavioral testing. Experimental modeling was performed for 4 weeks. SPT (1B) is performed at 28 days, FST (1C) at 29 days, OFT (1D) at 30 days, and 7.0 T MR GluCEST scanning at 31 days. SPT: sugar water preference test; FST: forced swimming test; OFT: open field test; CEST: 7.0 T MR GluCEST scan sequence; CUMS: chronic unpredictable mild stress model; CUMS-fluoxetine: chronic unpredictable mild stress model fluoxetine administration group. * indicates P<0.05; ** indicates P<0.01.

2.2 GluCEST成像

       MRI图像如图2所示。GluCEST测定值见表2、表3。与正常对照组相比，CUMS组双侧Glu浓度均明显升高，差异具有统计学意义（左侧P<0.001，右侧P=0.014）。与CUMS组相比，CUMS-fluoxetine组双侧Glu浓度均降低，差异具有统计学意义（左侧P=0.002，右侧P=0.025）。三组大鼠组内比较，左右侧海马Glu浓度差异不具有统计学意义。CUMS-fluoxetine组（左、右海马）Glu浓度接近正常组（图3）。

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图2  ROI选取的位置及所对应的CEST效应。2A：右侧海马区ROI的选取层面及位置；2B：左侧海马区ROI的选取层面及位置；2C：双侧海马区ROI的选取层面及位置；2D：正常对照组GluCEST伪彩图；2E：CUMS组GluCEST伪彩图；2F：CUMS-fluoxetine组GluCEST伪彩图。伪彩图中颜色越接近红色代表数值越高，CUMS组伪彩图较正常对照组接近于红色，CUMS-fluoxetine组伪彩图接近于正常对照组。CUMS：慢性不可预知轻度应激模型；CUMS-fluoxetine：慢性不可预知轻度应激模型氟西汀给药组；GluCEST：谷氨酸化学交换饱和转移。
Fig. 2  Selected ROI locations and corresponding CEST effects. 2A: Selected levels and locations of ROIs in the right hippocampus; 2B: Selected levels and locations of ROIs in the left hippocampus; 2C: Selected levels and locations of ROIs in the bilateral hippocampus; 2D: Pseudo-color plots of GluCEST in the normal control group; 2E: Pseudo-color plots of GluCEST in the CUMS group; 2F: Pseudo-color plots of GluCEST in the CUMS-fluoxetine group. The closer the color to red in the pseudo-color map, the higher the value, the pseudo-color map of CUMS group is closer to red than the normal control group, and the pseudo-color map of CUMS-fluoxetine group is closer to the normal control group. CUMS: chronic unpredictable mild stress model; CUMS-fluoxetine: chronic unpredictable mild stress model fluoxetine administration group; GluCEST: glutamate chemical exchange saturation transfer.

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图3  三组大鼠双侧海马区测定的GluCEST值。3A：三组大鼠左侧海马GluCEST测定值；3B：三组大鼠右侧海马GluCEST测定值；3C：三组大鼠双侧海马GluCEST测定值。n=12只/组。*P<0.05，**P<0.01。GluCEST：谷氨酸化学交换饱和转移。
Fig. 3  GluCEST values measured in the bilateral hippocampus of three groups of rats. 3A: GluCEST measurements in the left hippocampus of three groups of rats. 3B: GluCEST measurements in the right hippocampus of three groups of rats. 3C: Bilateral hippocampal GluCEST measurements in three groups of rats. n=12 rats/group. *P<0.05, **P<0.01. GluCEST: glutamate chemical exchange saturation transfer.

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表2  对照组与CUMS组大鼠双侧海马区测定的GluCEST值
Tab. 2  GluCEST values measured in the bilateral hippocampal region of rats in the control and CUMS groups

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表3  CUMS组与CUMS- fluoxetine组大鼠双侧海马区测定的GluCEST值
Tab. 3  GluCEST values measured in the bilateral hippocampal region of rats in the CUMS group and the CUMS-fluoxetine group

3 讨论

       本研究基于GluCEST成像技术，定量测定CUMS模型大鼠氟西汀治疗前后双侧海马区Glu浓度变化，结果显示抑郁症模型鼠治疗后双侧海马区的Glu浓度明显降低，接近于正常组大鼠海马区的Glu浓度，且与行为学的结果相一致，表明GluCEST成像技术在抑郁症的临床诊疗评估方面有一定的指导意义。

3.1 抑郁症动物模型的种类及CUMS模型的优势

       动物模型的构建是抑郁症基础研究的重要部分之一，目前最常使用啮齿动物进行研究^{[22, 23]}，包括慢性社交挫败应激（chronic social defeat stress, CSDS）、慢性束缚应激（chronic restraint stress, CRS）、获得性无助（learned helplessness, LH）、CUMS等相关模型。尽管上述造模方法在一定程度上能够模拟抑郁样行为，但均存在一定局限性：CSDS模型多适用于雄性啮齿动物，因雌性动物多具有较低的攻击力，较难实现社会挫败；CRS模型实验动物易产生适应性从而影响实验结果；LH模型与人类抑郁症状有一定相似性，但获得性无助症状是否为抑郁症患者所特有尚未被证实^{[22, 23]}。

       CUMS模型是在一段时间内，对动物进行一系列重复且不可预测的温和性刺激，从而诱导动物产生抑郁样行为^[23]；归因于模型中应激因子的多变性和不可预测性，可使动物产生长期有效的抑郁样行为。该模型（特别是大鼠）目前已被广泛用于抑郁症的相关研究^[24]，因其不仅主要模拟了人类抑郁核心症状即快感缺乏，还同时模拟如运动能力及社交能力降低、探索行为能力下降、攻击能力降低等其他症状，模型大鼠的抑郁样行为可持续3个月，且大多数抑郁样行为能够通过抗抑郁药物的治疗逆转^{[23, 24]}。因此，本研究中使用CUMS模型研究抑郁症优势明显，其模拟人类抑郁核心症状、持续时间长、能够通过抗抑郁药物治疗逆转，并被本研究中行为学的结果所证实。

3.2 抑郁症的疗效评估方法及GluCEST成像的优势

       目前，抑郁症的疗效评估方法主要有临床问诊、主观评估工具等[认知功能缺陷自评问卷（Perceived Deficit Questionnaire for Depression, PDQ-D）、神经心理认知评估工具连线测验B（Trail Making Test-Part B, TMT-B）、Stroop测验（Stroop Color-Word Test, SCWT）]，但这些方法存在认知症状主、客观评估结果不一致、对评定者要求较高等问题，难以实现客观、无创的有效评价。MRI能够无创检测脑内神经代谢物浓度，在抑郁症研究中具有较大的潜力。¹H-MRS是一种检测脑代谢物含量的MRI技术，但临床目前使用的低场强MR扫描仪不能区分Glu和Gln，检测结果的特异性较差；其次，¹H-MRS空间分辨率差，不能获得高质量的图像；再者，¹H-MRS一般通过比值实现量化分析，结果可能存在误差。因此，使用¹H-MRS检测Glu浓度、实现抑郁症的疗效评估，具有一定的局限性。GluCEST是一种具有较高敏感性和空间分辨率的分子成像技术，可无创定量检测脑区的Glu浓度，已被用于多种脑部疾病的研究（炎性、肿瘤及精神类疾病等）。既往研究基于GIuCEST成像技术发现一氧化碳中毒相关迟发性脑病大鼠的顶叶、海马及丘脑的Glu浓度升高^[25]，胶质瘤Glu浓度升高与既往辅助治疗相关，并且胶质瘤周围Glu浓度升高与近期癫痫发作相关^[26]，癫痫患者海马区Glu浓度减低^{[27, 28]}，证实了GluCEST在神经代谢研究领域的可靠性。

       海马区的神经生物学改变在抑郁症诊疗过程中起重要作用。与大脑皮层相比，海马体由于其独特的组织结构及功能，易受到兴奋、抑制平衡变化的影响，在抑郁症中变化尤为突出。因此，海马区的Glu浓度在一定程度上反映出疾病本身、疾病治疗前后的脑部代谢改变（神经递质）的特点^{[29, 30]}，选择海马区测定Glu浓度具有可行性。本研究通过GluCEST成像技术精确测定双侧海马区的Glu浓度变化，发现抑郁症模型鼠在治疗前海马区的Glu浓度较高，经氟西汀治疗后Glu浓度明显下降，接近正常大鼠的Glu浓度，表明GluCEST成像技术能够用于抑郁症模型鼠海马区的Glu代谢评估，在抑郁症相关脑改变的诊疗中有较好的应用价值。

3.3 GluCEST成像结果与行为学的相关性

       抑郁症的特征是持续性的情绪压抑和兴趣丧失，常具有社交回避、兴趣缺失、认知功能下降等行为特点。在本实验中，CUMS组大鼠出现了糖水偏爱率减低、强迫游泳测试不动时间延长、旷场测试运动距离降低等异常现象，表明此时大鼠已经处于抑郁症状态。Glu作为中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，与脑区的基本生理功能密切相关，其代谢功能障碍可能导致多种神经系统疾病，也是抑郁症发病机制的关键因素之一^[31]。Glu在突触前膜被释放后，一部分与Glu受体结合完成信号传递，另一部分被兴奋性氨基酸转运体摄取后清除^[32]；若出现异常，可导致Glu堆积产生兴奋性神经毒性作用，造成神经元凋亡或坏死，引起多种神经、精神类疾病的发生^[33]。对本实验中处于抑郁症状态的CUMS组大鼠进行GluCEST成像测定，发现双侧海马区的Glu浓度值均高于正常对照组，表明脑内Glu水平升高引起的Glu兴奋性神经毒性，可能是引起大鼠抑郁症表现的原因。

       氟西汀是临床常用的经典抗抑郁药物之一，是选择5-羟色胺（5-HT）再吸收抑制剂，具有抑制血清再吸收功效。本实验中使用氟西汀治疗CUMS模型鼠抑郁样行为，发现CUMS-fluoxetine组的大鼠糖水偏爱率升高，强迫游泳测试中的不动时间减少，旷场测试中的运动距离增加，表明氟西汀缓解了大鼠的抑郁样行为。既往研究认为，氟西汀能够降低脑内的Glu浓度，引起兴奋性神经毒性的减弱或消失，此外，氟西汀可显著缓解CUMS诱导的抑郁样行为^[34]，使海马区Glu浓度明显减低。氟西汀还可以预防星形胶质细胞萎缩保证突触中的Glu被及时清除，减少神经元损伤^{[35, 36]}。对CUMS-fluoxetine组大鼠进行GluCEST成像测定，发现双侧海马区的Glu浓度值均低于CUMS组，表明氟西汀治疗后脑内Glu水平降低，推测是兴奋性神经毒性减弱缓解了大鼠抑郁症行为。基于本实验中氟西汀治疗抑郁症CUMS模型大鼠行为学的改变及GluCEST成像大鼠海马区Glu的变化，我们认为，Glu浓度下降是由于氟西汀治疗引起，且GluCEST成像技术能够用于Glu测定及抑郁症疗效的评估。

3.4 本研究的局限性

       本研究的局限性有以下几点：（1）CUMS的造模过程较为烦琐，耗时较长，各实验室间的压力源类型差别较大，可能会对行为学的评估过程和结果造成影响；（2）GluCEST图像只能采集单层，且ROI的勾画只能手动完成，难以覆盖所有脑区，难以反映真实的脑区改变。随着3D GluCEST成像和自动分割技术的发展，这一技术有望得到完善，使其不但可以用于疗效评估，还可能进一步用于抑郁症的分级。

4 结论

       综上所述，GluCEST成像能够无创测定抑郁症模型鼠脑内的Glu浓度变化，与行为学具有良好的相关性，有助于抑郁症的分级、疗效评估与动态监测，为临床无创、定量评估抑郁症提供理论依据和新手段。