肝纤维化是各因素导致大量胶原和蛋白多糖等细胞外基质的过度沉积，研究证实早期(F2期以前)肝纤维化可以通过临床干预实现逆转^[1]，肝穿活检是其诊断金标准，但不能反映肝脏的全部病理改变；目前超声瞬时弹性成像(transient elastography，TE)、磁共振弹性成像(magnetic resonance elastography，MRE)^[2,3]、DWI是临床评价肝纤维化主要影像检查方法^[4]，但在诊断早期肝纤维化方面存在局限性。较传统的扩散加权成像(diffusion weighted imaging，DWI)成像主要依赖组织中水分子的布朗运动，在活体生物组织内水分子运动来自于两个方面，包括真正的水分子扩散和微循环灌注所致的水分子扩散效应，ADC值包含了水分子扩散运动和微循环灌注两种成分，并不能单纯地代表活体组织内真正的水分子运动。体素内不相干运动(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像通过双指数模型多b值数据拟合得到D、f和D^*三个重要参数，其中D值代表体素内真实水分子扩散成分；D^*和f是灌注相关参数，前者是伪扩散系数，表示组织内微循环灌注引起的假扩散效应，后者是灌注分数，即体素内伪扩散成分占总的水分子扩散成分的比例。故IVIM不仅能提示病灶内水分子的扩散受限程度，而且同时能够评估血流变化情况。

       本研究基于大鼠肝纤维化模型，探讨IVIM双指数模型参数D、D^*及f值对肝纤维化诊断及分期的能力，并将其与ADC值对肝纤维化的诊断和分期效能进行比较，为肝纤维化的早期诊断提供动物实验数据。

1　材料与方法

1.1　肝纤维化模型的制备

       由兰州大学动物中心选成年雄性SPF级SD大鼠^[5] (伦理委员会批件编号：LDYYLL2018-129) 66只，体重(200±10) g，健康状况良好，随机分为实验组55只和对照组11只，每次注射前称重以调整给药剂量，实验组0.3 mL/100g体重腹腔注射^[6]40% CCl4橄榄油混合液，对照组注射生理盐水，每周2次，共12周。

1.2　MRI扫描

       从第二周开始每周六取实验组(5只)和对照组(1只)共6只，0.7 ml/100 g体重腹腔注射0.5%戊巴比妥后将其以俯卧位头先进固定于线圈(西门子3.0 T Skyro扫描仪，大鼠专用线圈)中以减少运动伪影，进行如下扫描。

       常规序列：Ax TSE-T1WI：TR 721 ms，TE 8.6 ms；SE-T2WI-FS：TR 3000 ms，TE 109 ms；FOV 100 mm× 100 mm，层厚3 mm，间距0 mm，NEX为2；DWI：Ax SE-EPI，TR 5000 ms，TE 49 ms，FOV 180 mm× 180 mm，层厚3 mm，间距0 mm，NEX为1，b值取0、800 s/mm²。IVIM序列：Ax SE-EPI：TR 6400 ms，TE 106 ms，FOV 200×200 mm，层厚3 mm，间距0 mm，NEX为1，扩散敏感梯度方向数3，8个b值分别为0、50、150、200、400、600、800 s/mm²。

1.3　图像处理与数据测量

       使用Siemens Workstation后处理DWI序列得到ADC图。多b值IVIM原始数据导入Start MITK Diffusion后处理软件得到D、f和D^*图。为避免心脏及肝脏管道系统对图像质量和各参数值的影响，分别在肝脏右后叶尽量靠近病理活检部位的3个扫描层面上画取3个位置、大小尽量保持一致的感兴趣区(region of interest，ROI) (大小约3~4 mm²)，对比参考常规T2序列图像，求平均值。图像处理与数据测量均由两位影像医师在未知病理结果的情况下独立进行，遇分歧商议解决。

1.4　肝组织病理学检查

       所有MRI扫描后的大鼠均采用过量麻醉法处死，解剖取出肝组织固定、石蜡包埋切片，行HE染色。由2名资深病理医师采用Metavir标准对大鼠肝纤维化分期^[7]，进行双盲法诊断。Metavir标准将纤维化分为F0~F4期：F0期，无纤维化；F1期，汇管区及其周围纤维化和窦周少量纤维化；F2期，纤维间隔形成，但小叶结构基本未受到破坏；F3期，纤维间隔增多，破坏肝小叶结构，但无肝硬化；F4期，早期肝硬化。

1.5　数据统计处理

       使用SPSS 22.0对DWI及IVIM数据进行统计分析，结果用±s表示。通过Spearman检验分析DWI、IVIM各参数值与肝纤维化程度的相关性，采用独立样本t检验比较正常组与实验组(肝纤维化)大鼠的参数值，使用单因素方差分析的LSD-t检验法对肝纤维化各期的DWI及IVIM参数值进行两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。通过ROC曲线判断各参数值，即临界值(Cutoff值)、敏感度(Sen)(95%CI)、特异度(SPE)(95%CI)、阳性似然比(+LR)、阴性似然比(-LR)、Youden指数对各阶段肝纤维化的鉴别诊断价值，并给出最佳参数阈值。

2　结果

2.1　大鼠肝纤维化模型结果

       试验期间对照组11只全部顺利行MR扫描并纳入研究分析；实验组在建模期间4只死亡(第7、8周各1只，第10周2只)，6只扫描图像质量不佳被排除(第2周2只，第4、5、11、12周各1只)，共45只纳入研究分析(表1)。依据Metavir分级标准结果为：F1期8只，F2期13只，F3期14只，F4期10只，对照组11只为F0期。

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表1  大鼠肝纤维化模型制备情况
Tab. 1  Preparation of rat liver fibrosis model

2.2　T2WI压脂及IVIM扫描图像特点

       正常肝脏在T2WI压脂相上信号稍低，信号强度均匀一致，肝脏边缘规整光滑，肝实质内未见异常信号结节影；肝纤维化肝脏信号较高，实质信号不均匀，肝脏边缘不规整。随肝纤维化进展，肝实质扩散受限明显，IVIM图像信号逐渐升高(图1，图2)。

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图1  肝纤维化F0~F4期(A，B) T2压脂图像。A：正常小鼠肝组织；B：F1期肝纤维化，肝脏形态规则，信号均匀，与正常大鼠无明显差异；C：F2期肝纤维化，肝脏形态尚可，但内部血管走形僵硬，似可见结节样变，T2信号略升高，可能与CCL4造成的损伤相关；D：F3期肝纤维化，与F2期无明显差异；E：早期肝硬化，肝组织结节样变不明显，与早期肝纤维化表现相似
图2  肝纤维化F3(A，B)期IVIM序列图像。A：F3期肝纤维化大鼠IVIM融合图；B：体素内真性水分子扩散D图，D值为1.13×10^-3 mm²/s；C：灌注分数f图，f值为0.17；D：体素内微循环灌注D^*图，D^*值为35.27×10^-3 mm²/s
Fig. 1  F0—F4 phase (A, B) T2 liposuction image of liver fibrosis. A: normal mouse liver tissue. B: Picture, F1 stage liver fibrosis, liver shape regular, uniform signal, no significant difference with normal rats. C: F2 stage liver fibrosis, liver morphology is acceptable, but internal blood vessels Stiff-shaped, seemingly nodular changes, T2 signal slightly elevated, may be related to the damage caused by CCL4. D: F3 liver fibrosis, no significant difference with F2. E: early liver cirrhosis, nodular change of liver tissue is not obvious were not obvious and were similar to early liver fibrosis.
Fig. 2  Image of the IVIM sequence of liver fibrosis F4 (A, B). A: IVIM fusion map of F3 liver fibrosis rats. B: The D map of the true water molecule diffusion in the voxel, the D value is 1.13×10^－3 mm²/s. C: The perfusion fraction f map, the f value is 0.17. D: Intra-microcirculation perfusion D^* map, D^* value is 35.27×10^-3 mm²/s.

2.3.　DWI与IVIM评价指标与统计学分析结果

2.3.1　对照组与实验组DWI、IVIM各参数值对比

       对照组和肝纤维化组的ADC值均高于其D值，P< 0.05。实验组DWI、IVIM各参数均较对照组减低，差异均具有统计学意义，P<0.05(表2)。

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表2  对照组与实验组各参数值比较(±s)
Tab. 2  Comparison of values between the control group and the experimental group (±s)

2.3.2　肝纤维化各期DWI、IVIM各参数值比较

       分析结果显示随肝纤维化水平增加，ADC、D、f及D^*总体呈下降趋势(表3)。在DWI单指数模型中，F3和F4期ADC值具有显著差异(P<0.05)，F0和F1、F1和F2、F2和F3之间ADC值无显著差异。在IVIM双指数模型中，正常大鼠与肝纤维化F1期大鼠的D^*值有显著差异(P<0.05)；F1和F2期大鼠的D^*和f值有显著差异(P<0.05)；F3和F4期大鼠的D值有明显差异(P<0.05) (表3)。

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表3  对照组及实验组各期肝纤维化各参数值对比(56只，±s)
Tab. 3  Comparison of parameters of liver fibrosis in control group and experimental group (n=56, ±s)

2.3.3　DWI、IVIM各参数值与肝纤维化程度的相关性

       Spearman秩检验显示ADC、D、f及D^*值与肝纤维化严重程度呈负相关(r=-0.657，-0.668，-0.711，-0.851，P=0.01)(表4)。

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表4  肝纤维化与各参数的相关性
Tab. 4  Correlation between liver fibrosis and various parameters

2.3.4　DWI、IVIM各参数值诊断不同阶段肝纤维化的准确性

       由DWI、IVIM各参数评估肝纤维化的感受性曲线得出，D^*值对F0和F1~F4期、F0~F1和F2~F4期及F0~F2和F3~F4期的鉴别效能均优于ADC、D和f值(表5；图3A，图3B，图3C)；ADC在F0~F3和F4期的鉴别诊断上，ROC曲线下面积最大，具有较高的诊断效能(表5；图3D)。

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图3  A：DWI、IVIM各参数鉴别肝纤维化F0和F1~F4的ROC曲线；B：DWI、IVIM各参数鉴别肝纤维化F0~F1和F2~F4的ROC曲线；C：DWI、IVIM各参数鉴别肝纤维化F0~F2和F3~F4的ROC曲线；D：DWI、IVIM各参数鉴别肝纤维化F0~F3和F4的ROC曲线
Fig. 3  A: Identification of ROC curves of liver fibrosis F0 and F1—F4 by DWI and IVIM parameters. B: Identification of ROC curves of liver fibrosis F0—F1 and F2—F4 by DWI and IVIM parameters. C: Identification of ROC curves of liver fibrosis F0—F2 and F3—F4 by DWI and IVIM parameters. D: Identification of ROC curves of liver fibrosis F0—F3 and F4 by DWI and IVIM parameters.

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表5  DWI及IVIM各参数对不同阶段肝纤维诊断准确性
Tab. 5  Diagnostic accuracy of liver fiber in different stages of DWI and IVIM parameters

3　讨论

       慢性损伤导致的细胞外基质产生及降解的失衡是肝纤维化发展的主要机制，肝星状细胞(HSCs)未受到刺激时处于未激活状态，肝脏受损后，在炎症、损伤、坏死等因素作用下肝脏实质和非实质细胞开始分泌各种细胞因子，同时肝星状细胞激活为成纤维细胞和成肌纤维细胞，通过不断增生和分泌细胞外基质而打破细胞外基质的代谢平衡，使胶原蛋白基质异常沉积于肝脏形成肝纤维化^[8]。注射CCL4橄榄油混合液建立肝纤维化是经典的建模技术，较其他方法安全、稳定、高效，由于慢性肝炎活动与肝纤维化呈正相关，故利用一系列指标来区分慢性丙型肝炎活动程度的METAVIR分级可用于评价并量化肝纤维化^[9]，帮助确定治疗和检测疾病的发展，其中F0~F4肝纤维化程度由轻到重。IVIM参数在不同程度肝纤维化间有差异，相对于ADC值，IVIM参数可反映组织的扩散和灌注情况，可更全面、准确地反映肝纤维化早期的病理生理改变。

3.1　ADC值及IVIM相关参数D值、f值、D*值评价大鼠肝纤维化的诊断价值

       本研究实验组ADC值、D值、f值及D^*值均较对照组ADC值明显降低，差异具有统计学意义，与部分研究的结论一致^[10,11,12]，表明肝纤维化肝脏的水分子扩散和微循环灌注都受到限制。另外，本研究得出ADC值、D值、f值及D^*值与肝纤维化水平呈负相关(r=-0.657，-0.668，-0.711，-0.851，P=0.001)，与Franca等^[11]认为D值在正常肝脏与肝纤维化肝脏之间无显著差异的结论不一致，可能与本研究样本量较小有关。当肝纤维化程度进展，各参数值逐渐降低，其中ADC值和D值在肝纤维化晚期(F3期和F4期肝纤维化之间^[13,14])差异具有统计学意义，D^*值和f值在肝纤维化早期差异比较明显，前者在正常肝脏和F1期肝纤维化之间及F1期和F2期肝纤维化之间差异具有统计学意义，后者在F1期和F2期肝纤维化之间差异具有统计学意义。ADC值的减低一方面是因为肝纤维化时随着肝内胶原蛋白不断积累，限制了水分子的自由扩散，引起ADC值减低；另一方面是由于肝纤维化，肝细胞肿胀、变性，窦腔狭窄变形，肝内门脉高压，门静脉血流减少，代偿性增多的肝动脉血供不足以弥补门静脉血循环的减少也导致肝纤维化肝脏ADC值降低^[15]。D值代表体素内纯的水分子布朗运动，导致肝纤维化形成与发展的各种病因引起肝细胞损伤、坏死及炎症反应，继而合同大量纤维结缔组织异常沉积于肝内，这些病理变化引起水分子扩散运动受限，随肝纤维化进展，限制作用更明显，这可能是本研究中ADC值及D值随着肝纤维化进展逐渐减低的原因，且二者在肝纤维化后期甚至是肝硬化时显著减低^[15]。本研究显示肝纤维化肝脏D^*值低于正常肝脏，提示肝纤维化时肝脏微循环灌注减少，CT灌注^[13]已证实，肝硬化组的平均门静脉灌注较对照组降低，本研究得出D^*值在正常肝脏和F1期肝纤维化之间及F1期和F2期肝纤维化之间差异具有统计学意义，f值的作用各文献报道结果有差异^{[10,11,12,13,14,15,16]}，可能与扫描方案未标准化相关，本研究中f值在F1期和F2期肝纤维化之间差异具有统计学意义，提示血流灌注在肝纤维化早期变化比较显著，D^*和f值可以作为肝纤维化早期诊断和分期的敏感指标，与Zhang等^[15]和Sandrasegaran等^[16]的结论相同。且本研究中通过ROC曲线分析显示D^*值在F1期及以上、F2期及以上、F3期及以上肝纤维化具有较高的鉴别诊断效能，ADC在F0~F3期和F4期肝纤维化之间具有最高的鉴别诊断效能。

3.2　本研究的局限性

       本研究的局限性：(1)本研究以大鼠肝纤维化模型为研究对象，与人类病理变化过程存在差异，研究结果尚不能完全反映人体肝纤维化病理变化特点；(2) IVIM双指数模型考虑体内的纯水分子扩散成分和毛细血管内的伪扩散成分，忽略了体素内其他流动成分对结果的影响；(3)动物实验样本量较小，需要进一步扩大样本量证实研究结果的可靠性与可重复性。

       综上，IVIM双指数模型多参数值可以从水分子扩散和微循环灌注两方面诊断及评估肝纤维化水平，比DWI单指数模型更真实地表现肝纤维化病理变化特点，D^*值、ADC值对肝纤维分期具有应用价值，D^*值在鉴别诊断F0~F3期各期之间肝纤维化的效能最高，ADC值鉴别F0~F3期和F4期肝纤维化的效能最高，IVIM双指数模型多参数值结合DWI单指数模型参数ADC值对肝纤维早、晚期的鉴别诊断和分期更具有价值，但IVIM成像至今没有一种公认的标准化扫描方案，因此IVIM成像评价肝纤维化程度的价值还有待进一步探索。